Пошук академічних текстів

Реєстраційний номер

0220U102557, Науково-дослідна робота

Назва роботи

Генетичні та біохімічні аспекти регуляції деяких катаболічних та анаболічних процесів у мікроорганізмів: алкогольної ферментації, катаболізму метанолу, біосинтезу флавінів, гліцерину, водню та глютатіону

Керівник роботи

Сибірний Андрій Андрійович,

Дата реєстрації

25-03-2020

Організація виконавець

Інститут біології клітини НАН України

Опис

 На сьогодні механізми деградації власних цитозольних білків, а також рекомбінантних чужорідних білків біотехнологічного значення з цитозольною локалізацією у метилотрофних дріжджів залишаються нез’ясованими. Оскільки, дисфункція автофагії пов’язана із раком, нейродегенерацією, мікробною інфекцією і старінням, то дослідження різних аспектів автофагії на модельному об’єкті (метилотрофних дріжджах) та екстраполяція отриманих даних на інші еукаріотичні організми має важливе значення для медицини. Для дослідження можливих шляхів деградації цитозольних ферментів було обрано фруктозо-1,6-бісфосфатазу (FBP). У середовищі з глюкозою цей фермент швидко інактивується і деградує, тому є зручним модельним білком для досліджень. Сконструйовано рекомбінантні штами метилотрофних дріжджів K. pastoris з експресією генів, що кодують Fbp1 K. pastoris злиті з зеленим флуоресцентним білком GFP і одночасно експресують ген, що кодує червоний флуоресцентний білок RFP з PTS1 сигналом, для мічення пероксисом. Ці штами вирощували на середовищі з гліцерином, а потім переносили на середовище з глюкозою для стимулювання деградації FBP у K. pastoris. Також для мічення вакуоль було використано вакуолярний барвник FM 4-64. Дані флуоресцентної мікроскопії чітко продемонстрували, що Fbp1, деградує у вакуолях шляхом автофагії. Водночас деградація Fbp1 була пошкодженою у штама з блокованими вакуолярними протеїназами, що свідчить про істотну роль вакуолей у деградації Fbp1. Флуоресцентна мікроскопія підтвердила наші висновки про те, що Fbp1 у K. pastoris деградує вакуолярним шляхом. Запропоновано новий метод селекції мутантів K. phaffii з пошкодженням генів, пов’язаних з процесом автофагійної деградації цитозольних білків за рахунок використання β-галактозидази K. lactis злитої з GFP. Цей метод було використано для одержання інсерційних мутантів, у яких сповільнено процес деградації β-галактозидази після перенесення на глюкозу.

Опис продукції

Отримано рекомбінантні штами метилотрофних дріжджів K. pastoris з експресією генів, що кодують Fbp1 K. pastoris злиті з зеленим флуоресцентним білком GFP і одночасно експресують ген, що кодує червоний флуоресцентний білок RFP з PTS1 сигналом, для мічення пероксисом. для мічення вакуоль було використано вакуолярний барвник FM 4-64.Дані флуоресцентної мікроскопії чітко продемонстрували, що Fbp1, деградує у вакуолях шляхом автофагії. Водночас деградація Fbp1 була пошкодженою у штама з блокованими вакуолярними протеїназами, що свідчить про істотну роль вакуолей у деградації Fbp1.