Search academic texts

Registration Number

0823U101554, PhD dissertation

Status

Доктор філософії, 222, Медицина

Date

14-12-2023

popup.evolution

o

Title

Rationale for the use of tolerogenic dendritic cells obtained from cryopreserved progenitors in the treatment of autoimmune diseases (experimental study).

Author

Hanna H. Kisielova,

popup.head Anatoliy M. Goltsev
popup.opponent Tetiana I. Liadova
popup.opponent Koliada Tetiana I.
popup.review Igor P. Vysekantsev
popup.review Vladyslav G. Babijchuk

Description

Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей впливу кріоконсервування за різними режимами на структурні і функціональні характеристики мононуклеарів (МНК) кісткового мозку та дендритних клітин (ДК) отриманих з них in vitro. Суттєва увага в роботі приділяється оцінці толерогенного потенціалу отриманих з кріоконсервованих МНК ДК, а саме, здатності мінімізувати прояви у мишей ад’ювантного артриту (АА) як експериментальної моделі ревматоїдного артриту (РА) у людини. В роботі було використано наступні сучасні методи досліджень: кріоконсервування, культивування in vitro, проточна цитофлуориметрія, ПЛР в реальному часі, імуномагнітне сортування клітин, інвертована та світлова мікроскопія. Відпрацьовано метод виділення з кісткового мозку мишей СВА/Н 20-тижневого віку МНК у градієнті тразографу, який дозволяє отримати більш ніж 40 % клітин, серед яких 12 % становили CD14+-моноцити – попередники ДК. Визначені умови отримання з МНК кісткового мозку ДК з толерогенними властивостями методом культивування in vitro в присутності ГМ-КСФ (20 нг/мл), IЛ-4 (5 нг/мл) та дексаметозону (0,4 мкг/мл). Це дозволило одержати 96% клітин – кандидатів у ДК з високим рівнем життєздатності (92%). Для підтвердження незрілого толерогенного фенотипу ДК, отриманих в культурі, було підібрано панель маркерів для цитофлуориментричного аналізу. Встановлено, що диференціювання моноцитів у незрілі ДК супроводжується появою характерного для цих клітин маркера – CD11b, втратою CD14-антигена і мінімізацією рівня експресії костимуляторних молекул СD80, СD86. Продемонстровано, що важливою складовою патогенезу АА є дисрегуляція функції імунної системи на тлі розбалансування цитокінового профілю з переважним зростанням вмісту прозапальних цитокінів (ІЛ-6, ФНП-α, ІФН-γ) і дисфункції Т- регуляторної (Трег) ланки імунітету. Такі зміни супроводжувались підвищенням клініко-лабораторних показників: рівня сіалових кіслот, серомукоїдів, та індексу артриту (ІА). Вивчено вплив різних режимів (Р) кріоконсервування під захистом 10% ДМСО з повільною швидкістю охолодження: 1 град /хв до – 80ºС (Р1); до – 40ºС (Р2); до – 25ºС (Р3) з наступним зануренням у кожному випадку у рідкий азот (-196 ºС) на структурні та функціональні властивості МНК кісткового мозку. Показано, що змінюючи умови кріоконсервування можна збільшити толерогенний потенціал отриманих для імунотерапії ДК. Вперше доведено, що кріоконсервування МНК за розробленим режимом (Р2) у порівнянні із загальноприйнятим (Р1) забезпечував максимальні показники їх життєздатності, метаболічної активності, та вмісту CD14+ - попередників ДК, разом з високою експресією білків теплового шоку Нsp70 – індукторів їх толерогенної активності. Оцінка функціонального потенціалу ДК отриманих in vitro з кріоконсервованих МНК за Р2 продемонструвала більш високу їх толерогенну активность. Підтверджено, що підвищення вмісту Hsp70 в них сприяло збільшенню формування Т-регуляторних клітин (CD4+CD25+ та FOXP3+) і їх функіонального потенціалу за рахунок активації гена foxp3. Це призводило до зниження клінічної маніфестації аутоімунної патології у тварин. Встановлено пролонгований ефект імунотерапії дендритними клітинами, отриманими з кріоконсервованих за Р2 МНК. Аналіз вмісту CD4+CD25+- та FOXP3+-клітин, рівня експресії гена foxp3 і ІА на 7 і 14 добу після застосування різного виду толДК показав, що покращення клінічного статусу тварин з АА більшою мірою корелює з вмістом FOXP3+ Т-регулятрних клітин, ніж рівнем експресії гена foxp3. Продемонстрована здатність толДК отриманих з кріоконсервованих МНК корегувати порушений цитокіновий профіль з переважним стимулюванням продукції протизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-10) і нормалізацією клінічного стану тварин з АА. Зіставлення ступеня інгібіції прозапальних і стимуляції протизапальних цитокінів після різного виду толДК-терапії свідчить про їхню здатність реалізувати різноспрямовану і з різним ступенем активність по відношенню до цих цитокінів. Вперше встановлені переваги ДК з кріоконсервованих попередників, особливо за режимом 2 в прояві імунокорегуючої дії в порівнянні з ДК отриманими з нативних МНК. Отримані в роботі результати можуть бути використані лікарями-клініцистами які опановують і впроваджують методи клітинно-тканинної терапії в практику лікування АІЗ, в тому числі РА. Представлений матеріал демонструє можливість використання ультранизьких температур як «інструмента», що здатний спрямовано керувати толерогенним потенціалом ДК, отриманих з клітин-попередників.

popup.nrat_date

2025-02-13