Search academic texts

Information × Registration Number 0825U001810, PhD dissertation Status Доктор філософії Date popup.evolution o Title Improvement of African swine fever rapid diagnostics by molecular methods Author Maryna Y. Kit, popup.head Anatoliy P. Paliy popup.opponent Mykola Sytiuk popup.opponent Denys Kolybo popup.review Larysa V. Kovalenko popup.review Olena Kolchyk Description Африканська чума свиней (АЧС) ― це транскордонне емерджентне вірусне контагіозне захворювання домашніх та диких свиней, гостра форма якого спричиняє загибель інфікованих тварин на рівні 100 %. Захворювання поширене в країнах Африки, Європи, Азії та Океанії. Наразі засобів лікування та зареєстрованих в Україні вакцин проти АЧС немає, тому ключовою ланкою боротьби із захворюванням є його швидка та ефективна діагностика. Також відомо, що у країнах, де вірус добре вкорінився, спостерігається його циркуляція в популяціях диких свиней, у тому числі це стосується слабковірулентних штамів збудника, що не спричиняють загибелі інфікованих тварин і після захворювання роблять їх пожиттєвими вірусоносіями. З огляду на вищесказане, розробка вітчизняних методів діагностики є важливим завданням, а проведення скринінгових досліджень необхідне для встановлення ситуації щодо АЧС у популяції диких свиней на території України. У дисертаційній роботі на підставі проведених молекулярно-генетичних, молекулярно-біотехнологічних, серологічних, біоінформатичних та статистичних досліджень вдосконалено систему її лабораторної діагностики за рахунок розробки та впровадження методик виявлення ДНК збудника на основі полімеразної ланцюгової реакції, петльової ізотермічної ампліфікації та антитіл до нього на основі імуноферментного аналізу. За використання експресуючої системи E. coli було отримано 6 рекомбінантних протеїнів вірусу АЧС (р10, р32, р54, р54ΔТМ, лігаза, лігазаΔДЗД) та оптимізовано протоколи їх хроматографічного очищення. Для білків р54 та р32 показано можливість їх використання для детекції антитіл до збудника АЧС у сироватках крові свиней за допомогою ІФА та вестерн-блоту. Очищений за протоколом солюбілізації за допомогою детергентів рекомбінантний вірусний білок р32 є придатним для застосування його як антигена для проведення непрямого ІФА з метою детекції антитіл до вірусу АЧС. Його оптимальна концентрація складає 5 мкг/мл, розведення досліджуваної сироватки — 1:100 та вторинних антитіл — 1:10000. Внутрішньосистемний та міжсистемний коефіцієнти варіативності отриманих за допомогою розробленої методики результатів становлять 3,18 % та 7,59 % для позитивної та 1,56 % і 7,30 % для негативної сироваток відповідно. Розроблена тест-система для детекції генетичного матеріалу вірусу АЧС методом ПЛР у режимі реального часу «Sui–DNA–test–ASF virus» здійснює ампліфікацію фрагмента гена b646l збудника АЧС, забезпечує отримання специфічних, точних і відтворюваних результатів і виявляє 10 копій цільового гена в 1 мкл, що відповідає 20 копіям на реакцію. Сконструйований на основі проведених біоінформатичних досліджень позитивний контрольний зразок на основі плазмідного вектору pTZ57R/T_ASF зі вставкою гена b646l розміром 1763 п. н. кодує послідовності, які є цільовими для методів детекції ДНК вірусу АЧС, рекомендованих для використання ВООЗТ (класичної ПЛР та ПЛР у реальному часі). Розроблена методика детекції фрагмента гена c962r вірусу АЧС за допомогою петльової ізотермічної ампліфікації дозволяє проводити ефективне виявлення вірусу АЧС протягом 40 хв з лімітом детекції 10 копій цільового гена в 1 мкл досліджуваного зразка. Її специфічність за дослідження гетерологічних і референтних зразків ДНК вірусу АЧС становить 100 %, а внутрішньосистемний коефіцієнт варіативності результатів — 1,81 %, що відповідає вимогам до діагностичних тестів. Завдяки легкості проведення, метод може використовуватися в лабораторіях з обмеженими ресурсами і в польових умовах. Вдосконалений нами спосіб відбору ротової рідини диких свиней на канат з приманкою дозволяє використовувати його у польових умовах. Розроблений спосіб детекції гена nd5 Sus scrofa за допомогою петльової ізотермічної ампліфікації дозволив підтвердити приналежність диким свиням 56 зі 101 зразка, зібраного у 2020–2021 рр. на території Харківської області, з яких 15 зразків (26,7 %) містили генетичний матеріал збудника АЧС, що свідчить про вкорінення вірусу у популяції диких свиней у цьому регіоні. Registration Date 2025-05-20 popup.nrat_date 2025-05-20 Close