Registration Number
0519U000467, Doctoral dissertation
Status
Доктор біологічних наук
Date
05-06-2019
popup.evolution
.
Title
L- and D-lactate-selective oxidoreductases, recombinant yeast cells of Ogataea polymorpha and nanomaterials for the development of new enzymatic and biosensor approaches for the quantitative analysis of lactic acid
Author
Smutok Oleh V., Кандидат біологічних наук
popup.head Gonchar Mykhailo V.
popup.advisor Gonchar Mykhailo V.
popup.opponent Ivanytsia Volodymyr O.
popup.opponent Varbanets Ludmyla D.
popup.opponent Ostash Bohdan O.
popup.rada
Institute of Cell Biology
Description
Дисертація присвячена конструюванню дріжджових штамів – надпродуцентів L- і D-лактат-селективних оксидоредуктаз, очищенню ферментів та розробці на їх основі, у поєднанні із нанорозмірними матеріалами, нових спектрофотометричних та біосенсорних методів визначення вмісту L- та D-лактату, а також біореакторів для ензиматичного отримання чистих енантіомерів молочної кислоти.
За допомогою молекулярно-генетичних підходів сконструйовано рекомбінантні штами дріжджів Ogataea polymorрha: «tr1» (gcr1 catХ CYB2) – надпродуцент L-лактат: ферицитохром с-оксидоредуктази (флавоцитохрому b2, ФЦ b2), що характеризується восьмикратним підвищенням питомої активності відповідного ферменту в безклітинних екстрактах. Сконструйовано також рекомбінантний продуцент D-лактат: ферицитохром с-оксидоредуктази (DLDH) O. polymorрha «tr6» (gcr1 catX CYB2Δ/DLD1), питома активність DLDН якого збільшується у шість разів, порівняно з вихідними штамами, причому завдяки делеції гена CYB2 штам не синтезує ФЦ b2. Оптимізовано умови синтезу цільових ферментів для обох рекомбінантних штамів дріжджів.
Уперше розроблено новий метод очищення ФЦ b2 із екстрактів клітин штаму дріжджів O. polymorрha «tr1» афінною хроматографією на амінопропілсилохромі, модифікованому цитохромом с в ролі ліганда та отримано препарати фермента із питомою активністю 10 Од.·мг-1. Опрацьовано схему очищення мембранного фермента DLDН із клітин штаму дріжджів O. polymorрha «tr6» та отримано очищений препарат із питомою активністю 1,1 Од.·мг-1. Для обох ферментних препаратів проведено фізико-хімічну та ензимологічну характеристику.
Доведено можливість використання продуцентів L- та D-лактат-специфічних оксидоредуктаз для продукції чистого D-енантіомера із рацемату молочної кислоти та усунення D-лактату в модельних сумішах.
Уперше розроблено новий ензиматично-фотометричний метод кількісного аналізу L-лактату за використання рекомбінантного ФЦ b2 та «Берлінської блакиті». Опрацьовано спосіб реутилізації фермента для визначення вмісту L-лактату за використання ФЦ b2, іммобілізованого на магнітних мікрочастинках. Розроблено новий фотометричний метод кількісного аналізу D-лактату на основі використання клітин та субклітинних фракцій O. polymorрha «tr6» та утворення формазану як кінцевого кольорового продукту.
Синтезовано носії для іммобілізації ферментів на основі наночастинок золота. Розроблено новий метод формування золотих наночастинок на поверхні робочого планарного електроду in situ. За використання сканувальної електронної мікроскопії, рентгеноспектрального аналізу, атомно-силової мікроскопії та трансмісійної електронної мікроскопії проведено фізико-хімічну і структурну характеристику отриманих наноматеріалів.
На основі пермеабілізованих клітин штаму-надпродуцента ФЦ b2
O. polymorрha «tr1» сконструйовано нові мікробні амперометричні біосенсори з покращеними біоаналітичними характеристиками. Розроблено новий ензимний безмедіаторний амперометричний біосенсор «третього покоління» на L-лактат на основі очищеного рекомбінантного ФЦ b2 та наночастинок золота.
Розроблено та охарактеризовано нові мікробні біосенсори на D-лактат з використанням клітинних уламків, субклітинних фракцій, збагачених мітохондріями, та клітин рекомбінантного штаму O. polymorрha «tr6». Завдяки делеції гена CYB2, який кодує L-лактат-селективний флавоцитохром b2, мікробні біосенсори характеризуються високою селективністю до D-енантіомера лактату.
Розроблені біоаналітичні підходи на основі рекомбінантних клітин, клітинних уламків та очищених ферментів використано для кількісного аналізу L- та D-лактату в реальних зразках рідин людини, харчових продуктів та фармацевтичних препаратів трансфузійного призначення. Завдяки високій чутливості та селективності, а також надійності та простоті у використанні, опрацьовані ензиматичні та мікробні підходи кількісного аналізу лактату можуть знайти практичне використання в клінічній діагностиці, спортивній медицині та харчових технологіях.
Registration Date
2019-06-14
popup.nrat_date
2020-04-03 / 2026-06-29
