Registration Number
0825U000262, PhD dissertation
Status
Доктор філософії
Date
23-10-2024
popup.evolution
.
Title
CoAlation of Ribosomal Protein S6 Kinase 1 and its regulation by this modification
Author
Anna V. Bdzhola,
popup.head Oksana M. Malanchuk
popup.opponent Liudmyla B. Drobot
popup.opponent Liudmyla V. Garmanchuk
popup.review Boris S. Negrutskii
popup.review Serhii V. Kropyvko
popup.rada
Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine
Description
Дисертація присвячена дослідженню нового типу посттрансляційної модифікації кінази рибосомного білка S6 (S6K1) – КоАлюванню та його впливу на функціональну активність цієї кінази. S6K1 є одним із ключових компонентів mTOR/Akt1/S6K-залежного сигнального шляху, що регулює клітинний ріст, проліферацію, метаболізм та диференціацію. Порушення в регуляції цього шляху часто асоціюються з розвитком чисельних метаболічних захворювань, тому вивчення механізмів контролю активності p70S6K1 має значний науковий і прикладний інтерес. p70S6K1 зазнає ряду посттрансляційних модифікацій, зокрема КоАлювання, яке може впливати на її функціональність і стабільність. У ході дослідження було охарактеризовано моноклональні антитіла проти КоА. Антитіла продемонстрували високу специфічність до КоАльованих білків і можуть надалі слугувати потужним інструментом для детекції цих модифікацій в низці імунологічних методів.
За допомогою РХ-МС аналізу серед загального пулу КоАльованих білків було виявлено пептидну послідовність LTDFGLC*K, що належить родині S6K, а єдиним модифікованим амінокислотним залишком є цистеїн у положенні 217, що розташований в активаційній петлі кінази. Дослідження in cellular КоАлювання імунопреципітованої надекспресованої p70S6K1 підтвердило, що оксидативний стрес значно підвищує рівень КоАлювання кінази порівняно з клітинами, які культивували в нормальних умовах. Використовуючи методи імунофлюоресцентного аналізу та PLA, було продемонстровано, що КоАлювання ендогенного білка p70S6K1 відбувається у відповідь на метаболічний та оксидативний стрес різного походження. Це дає підстави вважати, що КоАлювання виконує протекторну роль, захищаючи S6K1 від надмірного окислення і подальшої інактивації чи деградації за умов підвищення рівня АФК у середовищі. Існування додаткового Cys231 в каталітичному центрі S6K1 передбачає можливість утворення зв’язку між ним та Cys217, що може перешкоджати приєднанню молекули КоА до Cys217. Для з’ясування цього питання було використано метод сайт-спрямованого мутагенезу і досліджено зміни рівня КоАлювання S6K1 в залежності від мутації одного з перерахованих цистеїнів у активаційній петлі. За результатами експериментів з експресії мутантних форм S6K1 в клітинах HEK293/Pank1β, що містили відповідно С217А та С231А заміни, було продемонстровано, що відсутність сайту КоАлювання Cys217 знижує рівень КоАлювання кінази на 30% порівняно з немутованою p70S6K1. Водночас, мутація Cys231 сприяє підвищенню рівня КоАлювання p70S6K1 на 40%, ймовірно, за рахунок звільнення тіольної групи Cys217 для молекули КоА, у випадку існування інтрамолекулярного дисульфідного зв’язку між Cys217 та Cys231. Отримані результати підтверджують КоAлювання Cys217 S6K1 і вказують на можливу регуляторну роль Cys231 в цьому процесі. Із використанням Bac-to-Bac системи експресії було отримано та охарактеризовано рекомбінантну форму конститутивно активної p70S6K1. Був використаний «дуальний» вектор, що дозволяє інфікованій клітині експресувати p70S6K1 в активній формі за рахунок ко-експресії з її активатором PDK1. Було виявлено, що ступінь КоАлювання рекомбінантного білка є дозо- та часозалежним. Оскільки відомо, що посттрансляційні модифікації S6K1 є ключовими в регуляції активності кінази, було досліджено можливість впливу процесу КоАлювання на активність рекомбінантної кінази S6K1 в умовах in vitro та продемонстровано, що КоАлювання знижує активність ензиму на 40%. Результати молекулярного докінгу підтверджують можливість формування дисульфідного ковалентного зв’язку між –SH групами КоА та Cys217 в активаційній петлі p70S6K1. Стабілізація АДФ залишку КоА відбувається унаслідок водневого, численних гідрофобних та йонних взаємодій всередині АТФ-зв’язуючої кишені. Внаслідок утворення такого комплексу відбувається конкуренція між молекулою КоА та АТФ за активний центр ферменту, що призводить до інгібування кінази. Методом симуляції молекулярної динаміки було встановлено, що комплекс КоА з активованою формою кінази більш стабільний у порівнянні з комплексом з нефосфорильованою формою ферменту. Отримані дані свідчать про те, що фосфорилювання є критично важливим для стабілізації взаємодії між p70S6K1 і КоА, що підкреслює значення КоАлювання у регуляції активованої форми кінази. Результати, отримані внаслідок проведеної роботи, свідчать, що КоАлювання S6K1 є важливим механізмом захисту білка від надмірного окислення. Окрім того, КоАлювання S6K1 за Cys217 має потенціал до інгібування активності S6K1. Такий механізм регуляції пов’язаний з типом взаємодії молекули КоА з S6K1 під час процесу КоАлювання, адже, окрім утворення дисульфідного зв’язку між -SH групами хвоста КоА та цистеїну кінази, КоА також стабілізує свій АДФ фрагмент в каталітичному центрі, перешкоджаючи зв’язуванню молекули АТФ та подальшій функціональній активності ферменту. Ці результати закладають основу для дослідження ролі КоА та КоАлювання у регуляції інших білків та відкривають нові можливості для розробки ефективних терапевтичних стратегій корекції патологій.
Registration Date
2025-01-15
popup.nrat_date
2025-01-15 / 2026-07-01
