Registration Number
0826U004307, PhD dissertation
Status
Доктор філософії
Date
23-09-2026
popup.evolution
.
Title
Development of a diagnostic biosensor system for the simultaneous determination of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase activities and their ratio
Author
Daryna O. Mruga,
popup.head Oleksandr O. Soldatkin
popup.opponent Volodymyr O. Chernyshenko
popup.opponent Mykhailo V. Gonchar
popup.review Igor Y. Dubei
popup.review Oksana S. Mankovska
popup.rada
Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine
Description
Робота присвячена розробці, оптимізації та апробації амперометричної біосенсорної системи для одночасного визначення активності аланінамінотрансферази (АЛТ) та аспартатамінотрансферази (АСТ) у біологічних рідинах людини.
Аланінамінотрансфераза та аспартатамінотрансфераза є ключовими біохімічними маркерами функціонального стану печінки та міокарда, рівень яких в крові суттєво зростає при патологіях печінки, серцево-судинних захворюваннях та низці інших патологічних станів. Одночасне визначення активності обох трансаміназ та розрахунок коефіцієнта де Рітіса (АСТ/АЛТ) мають важливе діагностичне значення для диференціації печінкових та кардіологічних захворювань. Традиційні лабораторні методи потребують складного обладнання, тривалої пробопідготовки та централізованої інфраструктури, що суттєво обмежує їх застосування для експрес-діагностики поза умовами стаціонарної лабораторії. Розробка портативних, чутливих та економічно ефективних біосенсорних систем для визначення трансаміназ є актуальним завданням сучасної біотехнології, що відповідає світовій тенденції розвитку персоналізованої медицини.
Проведений аналіз наукової літератури показав, що попри багаторічний досвід розробки біосенсорних систем для визначення АСТ і АЛТ, вони не досягли рівня комерціалізації і лише декілька здатні до одночасної диференційованої детекції обох ензимів, жодна з яких не була електрохімічною. Виходячи з цього, у роботі обґрунтовано вибір амперометричного методу детекції як оптимального для визначення активності трансаміназ завдяки низьким межам визначення, широкому лінійному діапазону, швидкому відгуку та незалежності від оптичних властивостей проби.
На першому етапі дослідження розроблено та оптимізовано АСТ-чутливий амперометричний біосенсор на основі глутаматоксидази (ГлОкс), іммобілізованої на платиновому дисковому електроді, модифікованому електрополімеризованим поліфенілендіаміном (ПФД). Оптимізовано склад біоселективної мембрани та робочого буфера, досліджено стабільність та селективність біосенсора, а також вплив концентрації вільного білку, йонної сили та коензиму в розчині на його функціонування.
На другому етапі створено та порівняно два варіанти АЛТ-чутливих біосенсорів – на основі піруватоксидази (ПОкс) та на основі ГлОкс. Вперше здійснено порівняльний аналіз характеристик обох типів біосенсорів та науково обґрунтовано вибір варіанту на основі ПОкс за критеріями специфічності, стабільності та відтворюваності.
Вперше розроблено мультианалітну електрохімічну біосенсорну систему для одночасного визначення активності АЛТ та АСТ шляхом інтеграції двох оптимізованих амперометричних моносенсорів. Оскільки обидві трансаміназні реакції продукують глутамат як спільний продукт, пряма диференціація сигналів була неможливою; для вирішення цієї проблеми запропоновано нову спеціалізовану процедуру послідовного внесення субстратів. Удосконалено також конструкцію біосенсорної системи шляхом застосування двошарової мембранної системи (ПФД + ензимна мембрана), що забезпечило ефективне блокування електроактивних інтерферентів і покращило селективність детекції у зразках сироватки крові.
Створена біосенсорна система характеризується лінійним діапазоном визначення 1–500 Од.акт./л для АЛТ та 1–200 Од.акт./л для АСТ за мінімальної межі визначення 1 Од.акт./л для обох ензимів; час повного аналізу становить близько 12 хвилин. Апробація системи на зразках сироватки крові людини підтвердила високу кореляцію отриманих результатів із референсним спектрофотометричним методом (коефіцієнти кореляції R=0,994 для АЛТ та R=0,989 для АСТ).
Розроблена система є першою електрохімічною біосенсорною системою, здатною до одночасної детекції обох трансаміназ, що відкриває можливості для автоматичного розрахунку діагностично значимого коефіцієнта де Рітіса безпосередньо в процесі вимірювання. Практичну цінність результатів підтверджено чотирма охоронними документами (патенти на винахід № 129239 та № 125811, патенти на корисну модель № 153303 та № 147481), затвердженою методикою вимірювання активності АСТ у ДП «Укрметртестстандарт» та впровадженням розробленого біосенсора в ТОВ «Укрмедсерт».
Отримані результати створюють підґрунтя для розробки портативних point-of-care пристроїв для експрес-діагностики функціонального стану печінки та серця безпосередньо біля ліжка пацієнта, моніторингу ефективності лікування пацієнтів із гепатопатологіями та серцево-судинними захворюваннями, а також скринінгових обстежень груп ризику (пацієнти з діабетом, метаболічним синдромом, хронічним алкоголізмом, вірусними гепатитами). Такий підхід є особливо актуальним для регіонів з обмеженим доступом до централізованих клінічних лабораторій.
Registration Date
2026-08-05
popup.nrat_date
2026-08-05 / 2026-09-30
