Інформація
Реєстраційний номер
0215U003391,
Назва роботи
ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ БІЛКІВ СИСТЕМИ ЗСІДАННЯ КРОВІ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ ТА ЛІКУВАННЯ ДВЗ-СИНДРОМУ.
Керівник роботи
Комісаренко Сергій Васильович, Доктор біологічних наук
Дата реєстрації
28-01-2015
Організація виконавець
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України
Опис
Метою даного проекту було одержання моноклональних повнорозмірних і рекомбінантних scFv-антитіл, високоспецифічних до протеїну С людини, придатних для створення на їх основі імунохімічних методів визначення протеїну С в плазмі крові людини для покращення діагностики синдрому дисимінованого внутрішньосудинного зсідання крові (ДВЗ-синдрому) та тромбофілії, а також створення стабільних клітинних ліній для одержання рекомбінантного протеїну С, який може бути застосований для лікування ДВЗ-синдрому. В роботі було застосовано сучасні хімічні, біохімічні, біоінформатичні, імунохімічні та молекулярно-біологічні методи. Протягом виконання проекту було визначено високоімуногенні унікальні амінокислотні послідовності молекули протеїну С, синтезовано пептиди, що відповідають цим послідовностям, та створено їх кон'югати з білками-носіями. Проведено гібридизацію спленоцитів мишей, імунізованих кон'югатом KLH-Pro144-Leu155, із клітинами мієломи Х-63Ag8. Одержано стабільний клон-продуцент моноклональних антитіл, специфічних до фрагменту Pro144-Leu155 протеїну С людини. Показано, що монАТ ІV-6А, які продукуються цим клоном, специфічно реагують із протеїном С людини та є придатними для розробки імуноферментних тест-систем для визначення протеїну С в плазмі крові. Також було показано, що монАТ ІV-6А є придатними для виділення та очистки протеїну С за допомогою афінної хроматографії. Із використанням генетичного матеріалу спленоцитів мишей, імунізованих цілою молекулою протеїну С та кон'югатом KLH із пептидом, що імітує фрагмент Pro144-Leu155 протеїну С людини, одержано бібліотеки імуноглобулінових генів миші, імунні до протеїну С людини та до ділянки Pro144-Leu155 протеїну С. Проведено відбір клонів-продуцентів рекомбінантних scFv-антитіл, які специфічно реагують із протеїном С людини. Найкращий клон субклоновано у векторі pET-22b та отримано високоекспресійний продуцент рекомбінантних scFv-антитіл, специфічних до протеїну С людини, на основі штаму E. coli Rosetta. Показано, що отримані scFv-антитіла 9Е розпізнають протеїн С людини в імуноферментному аналізі й імуноблотаналізі та є придатними для розробки імунохімічних методів визначення протеїну С. Одержано дві генетичні конструкції для експресії протеїну С в еукаріотичних клітинах на основі вектору pEGFP з різними промоторами (CMV та EF-1alfa). Трансфіковано ними клітини 3Т3, HEK293 та CHO та досліджено експресію клітинами протеїну С. Обрано високоефективний продуцент рекомбінантного протеїну С людини на основі клітин HEK293, трансфікованих pEGFP- N1-протеїн С. Протеїн С-специфічні рекомбінантні scFv-антитіла 9Е та монАТ ІV-6А в подальшому будуть використані для розробки імунохімічних тест-систем визначення протеїну С в плазмі крові людини, необхідних для діагностики тромбофілій і ДВС-синдрому, а також, у складі афінного сорбенту, для виділення та очищення протеїну С. Високоефективний продуцент рекомбінантного протеїну С може бути застосований для одержання протеїну С, як антитромботичного та асептичного препарату для лікування ДВЗ-синдрому та їнших патологій людини.
Опис продукції
Стабільний клон-продуцент моноклональних антитіл ІV-6А, які з високою специфічністю та афінністю реагують із протеїном С людини, що є придатними для розробки імуноферментних тест-систем для визначення протеїну С в плазмі крові людини та для виділення та очистки протеїну С за допомогою афінної хроматографії. Бібліотека імуноглобулінових генів миші, імунну до протеїну С людини та до ділянки Pro144-Leu155 протеїну С. Високоекспресійний продуцент рекомбінантних scFv-антитіл 9Е, специфічних до протеїну С людини, на основі штаму E. coli Rosetta. Показано, що scFv-антитіла 9Е розпізнають протеїн С людини в імуноферментному аналізі й імуноблотаналізі та є придатними для розробки імунохімічних методів визначення протеїну С. Стабільний високоефективний продуцент рекомбінантного протеїну С людини на основі клітин HEK293, трансфікованих pEGFP-CMV-протеїн С, та рекомбінантний протеїн С, який може бути застосований як антитромботичний та асептичний препарат для лікування ДВЗ-синдрому та тромбофілій.