Звіт по науково-дослідній роботі. Комісаренко Сергій Васильович. ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ БІЛКІВ СИСТЕМИ ЗСІДАННЯ КРОВІ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ ТА ЛІКУВАННЯ ДВЗ-СИНДРОМУ.

Реєстраційний номер

0215U003391, 0110U005967 , Науково-дослідна робота

Назва роботи

ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ БІЛКІВ СИСТЕМИ ЗСІДАННЯ КРОВІ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ ТА ЛІКУВАННЯ ДВЗ-СИНДРОМУ.

Назва етапу роботи

Керівник роботи

Комісаренко Сергій Васильович, Доктор біологічних наук

Дата реєстрації

28-01-2015

Організація виконавець

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Опис етапу

Метою даного проекту було одержання моноклональних повнорозмірних і рекомбінантних scFv-антитіл, високоспецифічних до протеїну С людини, придатних для створення на їх основі імунохімічних методів визначення протеїну С в плазмі крові людини для покращення діагностики синдрому дисимінованого внутрішньосудинного зсідання крові (ДВЗ-синдрому) та тромбофілії, а також створення стабільних клітинних ліній для одержання рекомбінантного протеїну С, який може бути застосований для лікування ДВЗ-синдрому. В роботі було застосовано сучасні хімічні, біохімічні, біоінформатичні, імунохімічні та молекулярно-біологічні методи. Протягом виконання проекту було визначено високоімуногенні унікальні амінокислотні послідовності молекули протеїну С, синтезовано пептиди, що відповідають цим послідовностям, та створено їх кон'югати з білками-носіями. Проведено гібридизацію спленоцитів мишей, імунізованих кон'югатом KLH-Pro144-Leu155, із клітинами мієломи Х-63Ag8. Одержано стабільний клон-продуцент моноклональних антитіл, специфічних до фрагменту Pro144-Leu155 протеїну С людини. Показано, що монАТ ІV-6А, які продукуються цим клоном, специфічно реагують із протеїном С людини та є придатними для розробки імуноферментних тест-систем для визначення протеїну С в плазмі крові. Також було показано, що монАТ ІV-6А є придатними для виділення та очистки протеїну С за допомогою афінної хроматографії. Із використанням генетичного матеріалу спленоцитів мишей, імунізованих цілою молекулою протеїну С та кон'югатом KLH із пептидом, що імітує фрагмент Pro144-Leu155 протеїну С людини, одержано бібліотеки імуноглобулінових генів миші, імунні до протеїну С людини та до ділянки Pro144-Leu155 протеїну С. Проведено відбір клонів-продуцентів рекомбінантних scFv-антитіл, які специфічно реагують із протеїном С людини. Найкращий клон субклоновано у векторі pET-22b та отримано високоекспресійний продуцент рекомбінантних scFv-антитіл, специфічних до протеїну С людини, на основі штаму E. coli Rosetta. Показано, що отримані scFv-антитіла 9Е розпізнають протеїн С людини в імуноферментному аналізі й імуноблотаналізі та є придатними для розробки імунохімічних методів визначення протеїну С. Одержано дві генетичні конструкції для експресії протеїну С в еукаріотичних клітинах на основі вектору pEGFP з різними промоторами (CMV та EF-1alfa). Трансфіковано ними клітини 3Т3, HEK293 та CHO та досліджено експресію клітинами протеїну С. Обрано високоефективний продуцент рекомбінантного протеїну С людини на основі клітин HEK293, трансфікованих pEGFP- N1-протеїн С. Протеїн С-специфічні рекомбінантні scFv-антитіла 9Е та монАТ ІV-6А в подальшому будуть використані для розробки імунохімічних тест-систем визначення протеїну С в плазмі крові людини, необхідних для діагностики тромбофілій і ДВС-синдрому, а також, у складі афінного сорбенту, для виділення та очищення протеїну С. Високоефективний продуцент рекомбінантного протеїну С може бути застосований для одержання протеїну С, як антитромботичного та асептичного препарату для лікування ДВЗ-синдрому та їнших патологій людини.

Опис продукції

Стабільний клон-продуцент моноклональних антитіл ІV-6А, які з високою специфічністю та афінністю реагують із протеїном С людини, що є придатними для розробки імуноферментних тест-систем для визначення протеїну С в плазмі крові людини та для виділення та очистки протеїну С за допомогою афінної хроматографії. Бібліотека імуноглобулінових генів миші, імунну до протеїну С людини та до ділянки Pro144-Leu155 протеїну С. Високоекспресійний продуцент рекомбінантних scFv-антитіл 9Е, специфічних до протеїну С людини, на основі штаму E. coli Rosetta. Показано, що scFv-антитіла 9Е розпізнають протеїн С людини в імуноферментному аналізі й імуноблотаналізі та є придатними для розробки імунохімічних методів визначення протеїну С. Стабільний високоефективний продуцент рекомбінантного протеїну С людини на основі клітин HEK293, трансфікованих pEGFP-CMV-протеїн С, та рекомбінантний протеїн С, який може бути застосований як антитромботичний та асептичний препарат для лікування ДВЗ-синдрому та тромбофілій.

Автори роботи

Богатирьова О. А.
Колеснікова І. М.
Костюченко О. П.
Литвинова Л. М.
Луговська Н. Е.
Луговськой Е. В.
Макогоненко Є. М.
Олійник О. С.
Паливода К. О.
Пидюра М.О.

Додано/оновлено в НРАТ

2020-04-02