Реєстраційний номер
0213U006512,
0112U000995
, Науково-дослідна робота
Назва роботи
Ізоформа фактора елонгації трансляції 1, eEF1A2, як потенційний онкомаркер
Назва етапу роботи
Керівник роботи
Шалак В.Ф.,
Дата реєстрації
14-10-2013
Організація виконавець
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Опис етапу
Фактор елонгації трансляції 1А (eEF1A) є ключовим компонентом апарату білкового синтезу в евкаріотній клітині. Існують дві ізоформи фактора елонгації трансляції 1А, скорочено eEF1А1 та eEF1А2, які є ідентичними на 92%. eEF1А1 експресується в переважній більшості тканин та клітин організму, за виключенням скелетних м'язів, серцевого м'язу і нейронів, в яких відбувається експресія eEF1А2. У випадку виникнення збою в експресії ізоформ, а саме, коли в нормальних клітинах "непрацюючий" ген, що кодує eEF1А2, починає свою експресію, може відбуватися злоякісна трансформація таких клітин. На сьогодні існують комерційно доступні моноклональні антитіла, які впізнають обидві ізоформи фактора елонгації трансляції, що робить проблематичним їх використання з метою диференціального визначення eEF1А2. В світі існує лише одна лабораторія, яка має антитіла проти eEF1A2 власного виробництва і використовує їх в імунологічних дослідженнях. Однак, слід зазначити, що ці антитіла не є комерціалізованими, а значить, поки що недоступні для використання іншими дослідниками. Метою проекту було створення специфічних антитіл проти ізоформи фактора елонгації трансляції eЕF1А2, визначення вмісту цієї ізоформи в пухлинах різної локалізації та пошук сигнальних шляхів, через які eЕF1А2 може впливати на злоякісну трансформацію клітини. Для втіленні мети проекту ми також обрали підхід, оснований на включенні відносно коротких (10-16 амінокислотних залишків) фрагментів амінокислотних послідовності eEF1А2 до складу імуногенних конструкцій. Було проведено комп'ютерний порівняльний аналіз амінокислотних послідовностей обох ізоформ на основі просторових моделей цих білків було обрано пептиди, що максимально відрізняються між собою і знаходяться на білковій поверхні, що буде робити їх доступними для впізнавання антитілами. Обрані пептиди eEF1А2 кон'югували з білком-носієм бичачим сироватковим альбуміном і проводили імунізацію тварин для генерації антитіл, які потім очищували і перевіряли їх специфічність Антитіла проти eEF1А2 володіли високою специфічністю, що дозволило нам використати їх для скринінгу гістологічних зразків пухлин різної локалізації методом імуногістохіімії і екстрактів пухлин методом імуноблотингу. В результаті ми виявили наявність білка eEF1A2 в 90% зразків раку легенів і приблизно 70% зразків раку шлунку людини, а також у всіх зразках раку молочної залози людини. Для визначення білків-партнерів eEF1A2 було обрано лінію клітин карциноми молочної залози людини. По-перше, ці клітини є злоякісними і, по-друге, в післяопераційних зразках пухлин молочної залози було встановлено наявність ізоформи eEF1A2 методом імуногістохімії. Ці клітини було трансфіковано створеними генетичними конструкціями, які експресують послідовності eEF1A1 та eEF1A2 злиті з HaloTag. Отримані білкові комплекси розділяли в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах і визначали білкові смуги для подальшої ідентифікації на мас-спектрометрі. Для виконання другого завдання, а саме дослідження взаємодії обох ізоформ фактора елонгації трансляції 1А з білками-партнерами in vitro, ми обрали три білка, які беруть участь у сигнальних шляхах клітини, в організації цитоскелету клітини і феномені РНК залежної інтерференції. Це зокрема кальмодулін, білок Argonaut, а також новий білок Sgt1, взаємодія якого з фактором елонгації трансляції нами було нещодавно виявлено. Нами вперше було встановлено, що eEF1A2 може утворювати комплекс з білком Argonaut за допомого антитіл специфічних до eEF1A2. Окрім цього, ми визначили, що ця ізоформа утворює комплекс саме з другою ізоформою білка Argonaut під час проходження мітотичної фази клітинного циклу.
Опис продукції
Афінно очищені анти-пептидні антитіла специфічно взаємодіють лише з eEF1А2 ізоформою і не взаємодіють з eEF1А1 як у вестерн-блот аналізі грубих екстрактів клітин,так і в імуногістохімії зразків парафінових зрізів.
Автори роботи
Єльська Г. В.
Вісловух А.А
Власенко Д.О
Негруцький Б.С.
Новосильна О.В
Порубльова Л.В
Додано/оновлено в НРАТ
2020-04-02
