Пошук академічних текстів

Інформація × Реєстраційний номер 0217U007292, 0116U002208 , Науково-дослідна робота Назва роботи Створення нових біосенсорних та ензиматичних методів визначення вмісту креатиніну як біомаркера функціонального стану нирок та контролю процесу гемодіалізу. Назва етапу роботи Керівник роботи Гончар Михайло Васильович, Кандидат педагогічних наук Дата реєстрації 27-12-2017 Організація виконавець Iнститут біології клітини НАН України Опис етапу Основними завданнями поточного етапу НДР було оптимізація препаративного виділення креатиніндеімінази (КДІ) із клітин рекомбінантного штама-продуцента, стабілізація фермента, його іммобілізація на мікроелектродах та нанокомпозитних носіях, створення лабораторного прототипу біосенсора на креатинін та опрацювання нового ензиматичного методу аналізу креатиніну за використання рекомбінантної КДІ. Опрацьовано оптимальну схему препаративного виділення та очищення (His)6-тегованої рекомбінантної КДІ з клітин штама-продуцента Escherichia coli BL21 із використанням метало-афінної хроматографії на Ni-NTA-агарозі. Досліджено стабільність отриманих препаратів КДІ та протестовано різні підходи для стабілізації фермента. Показано, що фермент стабільний упродовж тижня при 5 °С в 0,05 М фосфатному буфері, рН 7,5 (ФБ). Препарати фермента можна зберігати без значної втрати активності не менше 4 місяців при -20 °С у ФБ з додатком 20 % гліцеролу або у вигляді суспензії у цьому ж буфері при 70 % насичення сульфатом амонію, або ж у ліофілізованій формі в присутності трегалози як стабілізатора. Методом електрохімічного осадження здійснено синтез гібридних Cu-вмісних наночастинок на поверхні графітового електрода. Проведено дослідження структурних, фізико-хімічних та каталітичних властивостей одержаних наночастинок та досліджено електрохімічну активність сконструйованої хемосенсорної мембрани до іонів амонію. Електрофоретично гомогенний препарат КДІ з питомою активністю 10 мкмоль·хв?1·мг?1 білка використано для створення нового амперометричного біосенсора на основі амоній-чутливої хемосенсорної мембрани на основі електроосаджених гібридних Cu-вмісних наночастинок. Проведено тестування різних методів ковалентної іммобілізації КДІ на поверхні електрода та вибрано найбільш оптимальний підхід за використання формування на поверхні Cu-вмісних наночастинок моношару ?-меркаптогексадеканої кислоти, карбоксильну групу якої конденсують з аміногрупою білка N-гідроксисукцинімід-карбодіімідним методом. Сконструйований біосенсор характеризується широким діапазоном лінійності (0,02 - 7 мМ), швидкою відповіддю на аналіт (1 хв.), задовільною стабільністю при зберіганні (50% збереження вихідного сигналу після 14 днів) та високою селективністю до креатиніну. Опрацьовано високочутливий метод ензиматичного аналізу креатиніну за використання рекомбінантної КДІ з спектрофотометричною та флуориметричною детекцією продукту реакції (іонів амонію) з пороговою чутливістю близько 6 µМ та 0,2 µМ, відповідно. Опубліковано 19 статeй (9 - у зарубіжних журналах, 6 - у вітчизняних часописах, 2 розділи в іноземній монографії та 2 - у вітчизняній книзі), 13 тез доповідей. Подано до друку 4 статті в міжнародні видання та 1 патент України на винахід. 9 статей - у Scopus. Сумарний імпакт-фактор публікацій - 21,7. Опис продукції Біоаналітичні методи на основі рекомбінантних ферментів Автори роботи Іваш М.Ф. Гайда Г.З. Демків О.М. Закальська О.М. Закальський А.Є. Куцяба В.І. Прокопів Т.М. Серкіз Р.Я. Смуток О.В. Стасюк Н.Є. Додано в НРАТ 2020-04-02 Закрити