Реєстраційний номер
0218U001147,
0112U003291
, Науково-дослідна робота
Назва роботи
Потенційні онкобілки і білки-супресори пухлин головного мозку та їхня взаємодія із сигнальними шляхами клітин
Назва етапу роботи
Керівник роботи
Арешков Павло Олександрович, Авдєєв Станіслав Сергійович,
Дата реєстрації
24-01-2018
Організація виконавець
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Опис етапу
Об'єкт дослідження: пухлино-асоційовані білки CHI3L1 та CHI3L2 як активатори сигнальних каскадів. Метою проекту є з'ясування ролі взаємодії пухлино-асоційовані білків CHI3L1 та CHI3L2 з сигнальними каскадами MAPK/ERK1/2 та PI3K/AKT1 в набутті клітинами пухлинного та непухлинного походження проліферативних і інвазивних властивостей, a тaкoж пошук cпeцифiчниx iнгiбiтopiв цих процесів. Методи дослідження - зворотна транскрипція-полімеразна ланцюгова реакція (ЗТ-ПЛР), культивування клiтин ссавцiв та трансфекція, молекулярне клонування, Вестерн-блот аналіз, лазерна скануюча конфокальна мікроскопія, аналіз утворення клітинами колоній у напіврідкому середовищі, аналіз життєздатності клітин, імплантація клітин у мозок дорослих імунокомпетентних щурів. Проект спрямований на вирішення однієї з фундаментальних проблем молекулярної біології - встановлення та характеристика механізмів злоякісної трансформації клітин. Для розуміння біології онкогенезу важливим є ідентифікація генів, які змінюють свою експресію під час розвитку пухлини. Раніше методами експресійної генетики ми виявили групу генів з підвищеною експресією в гліомах i дослідили онкогенні властивості CHI3L1 та CHI3L2 як генів з найбільш вираженою зміною експресії з цього списку. Подальша порівняльна характеристика відповідних псевдохітиназ людини CHI3L1 та CHI3L2 вказала, що ці споріднені білки мають протилежний ефекти на ріст ліній клітин пухлинного та непухлинного походження. Вперше було показано, що на відміну від мітоген-стимулюючої дії CHI3L1, додавання рекомбінантного CHI3L2 до безсироваткового середовища клітин ліній U-251 та 293 призводить до зупинку їхнього росту. Протипухлинна терапія, спрямована на одну мішень, має лише посередню ефективність насамперед внаслідок розходження і конвергентності сигнальних шляхів, асоційованих з високоінвазивними і ангіогенними властивостями злоякісних неоплазій. Виявлення і характеристика пухлино-асоційованих білків із ріст-модулюючими властивостями є актуальним завданням для сучасної біології раку через можливість їх використання в нових комбінованих підходах лікування. У цій роботі нами встановлено, що присутність як глікопротеїну CHI3L1, так і рекомбінантного CHI3L2 у поживному безсироватковому середовищі призводить до стимуляції фосфорилювання ключових ланок сигнальних каскадів МАРК та РІ-3К - протеїнкіназ ERK1/2 і АКТ1, відповідно, в клітинах ліній 239 та U-251. Проте, ріст-інгібуючий вплив CHI3L2 опосередковується довгостроковим фосфорилюванням ERK1/2, тоді як додавання мітоген-стимулюючого глікопротеїну CHI3L1 призводить до короткотривалої активації цих кіназ. Аналіз локалізації активованих ERK1/2 в клітинах лінії 293 після обробки CHI3L1 та CHI3L2 засвідчив акумуляцію більшості фосфо-ERK1/2 в ядрі, тоді як у стимульованих цими білками клітинах лінії U-251 активовані форми протеїнкіназ локалізувалися в цитоплазмі. Це вказує на те, що внутришньоклітинна локалізація фосфорильованих ERK1/2 за дії хітиназоподібних білків залежить від типу клітин. Окрім того, показано, що характерною рисою клітинного сигналінгу, індукованого CHI3L1 та CHI3L2, є взаємодія між MAPK та PI-3K каскадами, яка може бути залучена до реалізації функціональних властивостей цих білків. Також було продемонстровано, що рецептор епідермального фактора росту (EGFR) та кіназа 1, яка регулює апоптозний сигнал (ASK1), можуть бути компонентами сигнальних каскадів, які опосередковують вплив CHI3L1 та CHI3L2 на клітини. Оскільки наші попередні результати аналізу злоякісної трансформації клітин кДНК CHI3L1 вказали на те, що цей ген можна розглядати в якості нового потенційного онкогена, то була продовжена характеристика клітинної лінії 293, зі стабільною та ектопічною продукцією відповідного білку. Показано, що інтракраніальна імплантація клітин 293_CHI3L1 призводить до утворення пухлин у головнoму мозку щурів за відсутності системної імуносупресії. На основі цих даних, нами запропоновано нову модель пухлини головного мозку, яка може бути використанa для перевірки протипухлинних препаратів. Завдяки дослідним розробкам, лікарські препарати на основі олігонуклеотидів є перспективним напрямком сучасної онкології. Багато з них вже використовуються у клініці а їхня якість підвищується завдяки кінцевим етапам клінічних випробувань. Важливим інструментом вивчення біологічних ефектів генів та відповідних їм білків є маніпуляція рівнем їхньої експресії в клітинах із застосуванням молекул коротких інтерферуючих РНК (кіРНК). З метою перевірки можливості використання аберантної експресії CHI3L1 як прогностичної ознаки, або терапевтичної мішені для кoмплекcнoї терапії CHI3L1-асоційованих пухлин, в ході виконання НДР нами були використані дві кіРНК, які відповідають послідовності мРНК CHI3L1 на межі 6-го і 7-го екзонів та 10-го екзону, відповідно. Експериментальні дані вказують, що пригнічення продукції глікопротеїну CHI3L1 специфічними короткими інтерферуючими РНК (кіРНК) призводить до супресії ознак злоякісної трансформації клітин 293_CHI3L1. Більш того, використання кіРНК_CHI3L1 в комбінації з обробкою клітин антагоністами брадикініну чи похідними 4-тіазолідинонів, потенційними протипухлинними препаратами з широкий спектром біологічних властивостей, має наслідком посилення цитотоксичного ефекту. Одержані результати суттєво розширюють існуючі уявлення про біологічні властивості генів CHI3L1 і CHI3L2 та відпоідних їм білкових продуктів насамперед у виникнені та прогресії злоякісних пухлин, зокрема гліом, а також дозволяють розглядати їх в якості мішеней при розробці нових терапевтичих підходів лікування асоційованих з ними захворювань.
Опис продукції
Запропоновано методики виявлення та оцінки пухлино-асоційованих білків CHI3L1 та CHI3L2 у гліомах різного ступеню злоякісності, як генів з найбільш вираженою зміною експресії у пухлинах мозку
Автори роботи
Єршов А.В.
Бельтюкова Л.В.
Губернаторова А.О.
Кашуба В.В.
Чаусовський Т.І.
Додано/оновлено в НРАТ
2020-04-02
