Пошук академічних текстів

Інформація × Реєстраційний номер 0218U005114, 0115U001360 , Науково-дослідна робота Назва роботи Механізми деградації пероксисомних та цитозольних білків у метилотрофних дріжджів та створення надпродуцентів білків промислового значення на основі мутантів з пошкодженням цих механізмів Назва етапу роботи Керівник роботи Сибірний Андрій Андрійович, Дата реєстрації 01-03-2018 Організація виконавець Iнститут біології клітини НАН України Опис етапу Максимальне зниження рівня деградації цільового рекомбінантного білка у цитозолі є запорукою створення надпродуцентів білків промислового значення. Відсутність зручних методів аналізу мутантів P. pastoris з порушеною деградацією цитозольних білків безпосередньо в дріжджових колоніях ускладнює не лише ізоляцію мутантів, але й ідентифікацію відповідних генів. Однак, такі мутанти можна аналізувати на моделі гетерологічного фермента b-галактозидази, для якого існують зручні методи аналізу. Для цього було сконструйовано вектор для експресії b-галактозидази (LAC4) з Kluveromyces lactis під контролем метанол-регульованого промотора pFLD1. Даний вектор було використано для отримання штамів P. pastoris з експресією гетерологічного білка b-галактозидази на основі штаму дикого типу GS200, а також штаму SMD1163 з пошкодженою автофагією. Таким чином, методом електротрансформації отримано штами P. pastoris з експресією гетерологічного білка b-галактозидази під контролем pFLD. Одержані штами перевіряли за допомогою ПЛР - аналізу та проводили якісне визначення b-галактозидази за умов індукції метанолом промотора гену формальдегіддегідрогенази. При культивуванні даного штаму в середовищі з метанолом та аналогом лактози X-gal або ж при поверхневій заливці реакційною сумішшю, що містить ONPG, утворюються нерозчинні яскраво-синій чи жовтий барвники відповідно, що свідчить про наявність активного білка b-галактозидази. При вивчені деградації b-галактозидази, клітини вирощені на метанолі переносили на середовище з глюкозою. Встановлено, що b-галактозидаза частково деградує шляхом автофагії. Окрім того, сконструйовано вектори для експресії фруктозо-1,6-бісфосфатази з E. сoli та P. pastoris під контролем регульованого промотора гена FBP1 та під контролем конститутивного промотора гена GAP1. Опис продукції Сконструйовано вектор для експресії бета-галактозидази (LAC4) з Kluveromyces lactis під контролем промотора гену FLD, що індукується метанолом, та отримано штами P. pastoris з гетерологічною експресією LAC4 під контролем промотора FLD на основі штаму дикого типу GS200, а також штаму SMD1163 з пошкодженою автофагією, з метою подальшої ізоляції мутантів з порушеною деградацією цитозольних білків безпосередньо в дріжджових колоніях. Автори роботи Булботка Ніна Володимирівна Дмитрук Олена Валеріївна Левків Катерина Олександрівна Сибірний Андрій Андрійович Додано в НРАТ 2020-04-02 Закрити