Search academic texts

Information × Registration Number 0418U001751, Candidate dissertation Status Кандидат біологічних наук Date 22-05-2018 popup.evolution o Title Preparation of highly active concentrate of blood coagulation factor VIII with the use of affinity chromatography on dye-silica carriers Author Shurko Natalia Olehivna, popup.head Danysh Taras Vasylovych popup.opponent Lootsik Maxim Dmytrovich popup.opponent Savchuk Olexiy Mykolayovych Description Дисертація присвячена створенню нового методу отримання очищеного препарату фактора VIII зсідання крові із застосуванням макропористих кремнеземних сорбентів із іммобілізованими активними барвниками; синтезу та дослідженню властивостей макропористих кремнеземних сорбентів із активними барвниками в ролі лігандів, придатних для очищення фактора VIII зсідання крові; використанню різних хімічних речовин в ролі вірус-інактивуючих агентів у процесі очищення; розробці схеми отримання високоактивного вірус-безпечного препарату фактора та вивченню його біохімічних властивостей. Встановлено, що процес очищення фактора VIII відбувається завдяки явищу негативної афінної сорбції. Фактор VIII не сорбується жодним зі синтезованих сорбентів. Проте, його питома активність у супернатані зростає, що пов’язано з сорбцією із досліджуваного розчину нецільових білків. Серед досліджуваних сорбентів виділено групу, для якої характерне найкраще зв’язування нецільових білків: Діасорб-Активний пурпуровий 4ЖТ, Діасорб-Procion Gelb M4R, Діасорб-Procion Blue HB, Діасорб-Procion Blue MXR і Діасорб-Активний яскраво-голубий К. Виявлено, що на сорбцію білків впливає рН розчину (вищий ступінь очищення досягається при рН 7,4). Виявлено, що при виборі хроматографічного сорбенту важливим є не лише вибір ліганду, але й властивості самої матриці. Так, зокрема, продемонстровано, що найкраща сорбція нецільових білків досягалася на сорбенті з розміром пор 750 Å (найвищий ступінь очищення фактора VIII). Проведено дослідження впливу методів попереднього фракціонування у поєднанні з методом негативної афінної сорбції для створення схеми отримання високоочищеного препарату фактора VIII з плазми крові. Встановлено, що попереднє фракціонування барій цитратом, алюміній гідроксидом (ІІІ) та ПЕГ-4000 забезпечує видалення факторів протромбінового комплеку, фібриногену, фібронектину, ліпопротеїдів, денатурованих білків, альбуміну тощо. На цьому етапі досягли стократного очищення препарату фактора VIII (від 0,017±0,001 до 1,88±0,11 МО/мг білка для сорбенту Діасорб-Активний пурпуровий 4ЖТ). Продемонстровано, що застосування іонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose та афінної хроматографії на відібраних кремнеземних макропористих сорбентах забезпечує одержання фактора VIII з Кріопреципітату зі ступенем очищення від 129 до 242 разів та збереженням до 73–76 % від вихідної прокоагулянтної активності. Основні втрати від вихідної активності фактора VIII і фон Вілебранда (до 27 %) відбувалась на етапі іонообмінної хроматографії. Оскільки, очищення фактора на кремнеземних сорбентах відбувалось завдяки явищу негативної афінної хроматографії, це забезпечувало практично сто-відсотковий (96,34 %) вихід продукту та є ще однією суттєвою перевагою даного методу в технології отримання очищеного препарату. Виявлено, що поєднання етапів попереднього фракціонування, іонообмінної та афінної хроматографії забезпечує ступінь очищення в межах 239–700 разів, залежно від типу вибраного сорбента. Найкращий результат досягли у досліді використання Діасорб-Активний пурпуровий 4 ЖТ. Для одержання вірус-безпечного препарату досліджено можливість застосування відомих ефективних методів антивірусної обробки: сольвент-детергентного та тіоціанатного. Запропоновано етапи включення кожного з методів у схему отримання препарату та способи видалення вірус-інактивуючих агентів. Оптимальне місце застосування цих методів є перед етапом кріоосадження, оскільки основна їх частина залишається у супернатанті. Registration Date 2018-05-22 popup.nrat_date 2020-04-03 Close