Реєстраційний номер
0820U100250, Дисертація доктора філософії
На здобуття
Доктор філософії
Дата захисту
28-09-2020
Статус
Захищена
Назва роботи
Біотехнологія субстанції рекомбінантного інтерлейкіну-7 людини
Здобувач
Мотроненко Валентина Василівна,
Керівник Ружинська Людмила Іванівна
Керівник Галкін Олександр Юрійович
Опонент Баль-Прилипко Лариса Вацлавівна
Опонент Поєдинок Наталіїя Леонідівна
Рецензент Голуб Наталія Борисівна
Рецензент Щурська Катерина Олександрівна
Установа, організація, у вченій раді якої відбудеться/відбувся захист
Національний технічний університет України "Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського"
Опис
Інтерлейкін-7 людини (ІЛ-7) – лімфопоетичний фактор росту, який займає особливе положення серед інших цитокінів через його унікальну функцію в гематопоезі, що не дублюється іншими факторами. Відсутність функціонального ІЛ-7 може бути однією з причин важкого комбінованого імунодефіциту. Результатом відсутності функціонального ІЛ-7 в організмі є лімфопенія та, як наслідок, важкий імунодефіцит. При збільшенні кількості ІЛ-7 рівень В- і Т-лімфоцитів в крові підвищується. ІЛ-7 бере участь у формуванні лімфовузлів. Основними продуцентами ІЛ-7 є стромальні клітини кісткового мозку та тимуса, а також деякі інші клітини організму людини.
Наукова новизна отриманих результатів. Оптимізовано склад живильного середовища для біосинтезу рІЛ-7 бактеріями E. coli (вихід – 0,95 мг/мл) із високою біологічною активністю in vitro та in vivo, що дозволило підвищити вихід рІЛ-7 у 1,3 рази у порівнянні із базовою технологією. Показано стимулюючу дію екстрактів клівії кіноварної і зеферантесу великоквіткового (0,5-1,0%) та ліпосомальної форми вітаміну К1 (15-25 мг/мл) як стимулюючих добавок до поживного середовища (приводить до збільшення виходу цільового продукту у 1,69 рази). Біологічно активні речовини досліджених фітоекстрактів взаємодіють з поринами зовнішньої мембрани E. coli, що, ймовірно, є причиною підвищення біосинтетичної активності рекомбінантного продуцента. Показано, що застосування рІЛ-7 (5мкг рІЛ-7 на добу внутрішньочеревно, щодня до загоєння рани) прискорює швидкість загоєння ран у дослідних тварин та елімінації Pseudomonas aeruginosa із них. Результати роботи доповнили сучасні науково-методичні підходи створення препаратів рекомбінантних білків терапевтичного призначення.
Експериментально обґрунтовано раціональний кількісний склад органічних компонентів та мінеральних речовин живильного середовища для культивування рекомбінантного продуценту E. coli, що дозволило збільшити вихід рІЛ-7 у 1,3 рази.
Доведено стимулюючу дію екстрактів клівії кіноварної і зефірантесу великоквіткового як добавок до живильного середовища при культивуванні рекомбінантних бактерії E. coli в діапазоні 0,5-1,0%, що забезпечувало підвищення виходу цільового продукту в 1,69-1,82 рази. Показано стимулюючий вплив ліпосомальної форми вітаміну К1 в концентрації 15-25 мг/мл на рівень біосинтезу рІЛ-7 (збільшення в 1,74-1,81 рази). Показано, що механізми біологічної активності фітоекстрактів на синтез рІЛ-7 бактеріальними продуцентами, включають взаємодію з поверхневими структурами бактеріальної клітини.
Розроблено удосконалену схему очистки рІЛ-7 за рахунок введення стадії високоспецифічної імуноафінної хроматографії, що дозволило досягти чистоти отримуваної субстанції на рівні 98%. Для синтезованої імуноафінної колонки на основі тетраетоксисилану визначено раціональні технологічні параметри хроматографічної очистки, які дозволяють отримувати восокоочищений продукт упродовж 15 циклів безперервної роботи та у широкому діапазоні концентрацій продукту (0,005-20мкг/мл).
Експериментально доведено ефективність застосування рІЛ-7 при лікуванні ранової інфекцій P. aeruginosa. Показано, що у мишей, які отримували лікування препаратом рІЛ-7 (5мкг на добу внутрішньочеревно), загоєння ран і елімінація збудника наступає на 5 днів раніше, ніж у мишей без лікування препаратом рІЛ-7.
Розроблено технологічну та апаратурно-технологічну схему отримання субстанції рІЛ-7 людини на основі отриманих експериментальних даних. Проведено оцінку ризиків технологічного процесу отримання субстанції рІЛ-7 та визначено найбільш критичні стадії, що дозволило розробити систему контролю виробництва для запобігання та мінімізації ризиків.
Проведено техніко-економічну оцінку розробленої технології отримання субстанції рІЛ-7: визначено собівартість кінцевого продукту та потужність виробництва з огляду на забезпеченість пацієнтів України та поширеність відповідних патологій. Розрахункова потужність виробництва склала 240г субстанції рІЛ-7 на рік, а її собівартість – 43 478грн. Розрахункова сировина собівартість готової ін’єкційної форми препарату рІЛ-7 (3-60мкг на дозу) становить 38-1512грн., що обумовлює його соціальну доступність для населення України.
Дата реєстрації
2020-10-12
Додано/оновлено в НРАТ
2021-03-17 / 2026-06-30
