Registration Number
0826U003306, PhD dissertation
Status
Доктор філософії
Date
03-09-2026
popup.evolution
.
Title
Functional relationships between estrogen receptor ESR1 isoforms and ribosomal protein S6 kinase (S6K1) isoforms in human breast carcinoma MCF-7 cells
Author
Andrii V. Mazov,
popup.head Valeriy V. Filonenko
popup.opponent Liudmyla B. Drobot
popup.opponent Larysa M. Shlapatska
popup.review Volodymyr I. Kashuba
popup.review Serhii V. Kropyvko
popup.rada
Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine
Description
Дисертація присвячена дослідженню взаємозв'язку між функціональною активністю ізоформ естрогенового рецептора ESR1 та кінази рибосомного білка S6K1 у клітинах карциноми грудної залози MCF7.
Створено та охарактеризовано поліклональні антитіла миші до ESR1 людини. Як антиген використовували два рекомбінантні білки з таговою послідовністю (6xHis) для афінної очистки: пептид N-кінцевого фрагмента (1-120 а.к.) та повнорозмірний протеїн ESR1. N-кінцевий фрагмент виявився неімуногенним, натомість імунізація повнорозмірною формою дозволила отримати антитіла, ефективні для імунопреципітації. Копреципітація з анти-ESR1 та анти-S6K1 (С-кінцевими) антитілами не виявила утворення мультиензимного комплексу.
Для дослідження ролі ізоформ ESR1 у регуляції S6K1 методом CRISPR/Cas9 (вектор pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0, таргетинг 1-го екзону) та селекцією зеоцином створено сублінії MCF7 з диференційною експресією ESR1. Сублінія MCF7/9 має повне пригнічення головної ізоформи р66/ESR1 і часткове збереження мінорної р36/ESR1. У сублінії MCF7/12 встановлено 50% пригнічення р66/ESR1 та кількаразове підвищення мінорної ізоформи р46/ESR1, що є компенсаторним механізмом через підвищення рівня транскрипції мРНК ESR1 (за даними ПЛР у реальному часі).
Перевірка гіпотези про ініціацію епітеліально-мезенхимного переходу (ЕМТ) сублінією MCF7/9 (аналіз маркерів CDH1, CDH2, Vim) не виявила ознак ЕМТ. Натомість повне пригнічення р66/ESR1 призвело до зниження активності S6K1 (пригнічення фосфорилювання за сайтом Ser389), що пов'язано із загальним зменшенням експресії протеїну та мРНК S6K1. Отримані дані свідчать, що ESR1 є транскрипційним активатором S6K1, а його пригнічення корелює з гальмуванням S6K1-залежного сигналювання. Зниження S6K1 у MCF7/9 негативно впливало на проліферацію клітин. Водночас зміни ESR1 пригнічували міграцію клітин (зі статистично значущою різницею для MCF7/9), що вказує на причетність р66/ESR1 до цього процесу, імовірно завдяки пригніченню S6K1-залежного сигналювання.
Вперше досліджено роль ізоформ S6K1 у регуляції фосфорилювання ESR1 за залишками Ser167 та Ser118. На модельних сублініях MCF7 з відновленою експресією окремих ізоформ S6K1 показано, що експресія р70 та р60 суттєво підвищує фосфорилювання ESR1 за Ser167, тоді як р85 не має впливу. Аналіз фосфорилювання за Ser118 виявив, що навпаки, експресія р85 сприяє його підвищенню, а р60 чи р70 не впливають. Створено мутантні сублінії MCF7 з мімікрією сайту (Ser167Asp) та блокуванням (Ser167Ala). Вперше встановлено, що фосфорилювання Ser167 не має регуляторної ролі в активації S6K1.
Вперше визначено особливості експресії ізоформ S6K1 у пухлинах грудної залози людини. Виявлено підвищення експресії р70 та р85 у люмінальних А- і Б-типах, та їхнє пригнічення у потрійно-негативному типі. Вперше у пухлинах усіх молекулярних субтипів виявлено пригнічення експресії мРНК ізоформи р60S6K1 порівняно з умовно-нормальною тканиною. Встановлено спільну динаміку змін експресії ESR1 та ізоформ S6K1 в усіх досліджуваних типах пухлин.
Визначення функціональних зв'язків ESR1 та S6K1 відкриває нові можливості для пошуку мішеней у терапії раку грудної залози та розуміння молекулярних механізмів набутої резистентності, пов'язаної з активацією каскаду mTOR/S6K1. Оскільки ізоформи р70 та р60 фосфорилюють ESR1 за Ser167, а р85 впливає на критичний для зв'язування з ДНК сайт Ser118, ці ізоформи є перспективними терапевтичними мішеннями. Створені моделі клітин MCF7 стануть основою для подальшого поглибленого аналізу молекулярних механізмів регуляції ESR1.
Registration Date
2026-07-09
popup.nrat_date
2026-07-09 / 2026-09-28
