Реєстраційний номер
0825U003154, Дисертація доктора філософії
На здобуття
Доктор філософії
Дата захисту
15-09-2025
Статус
Захищена
Назва роботи
Участь гіпокальцину в NMDA-рецептор залежній довготривалій синаптичній депресії
Здобувач
Оліфіров Борис Олексійович,
Керівник Білан Павло Володимирович
Опонент Жолос Олександр Вікторович
Опонент Крисанова Наталія Валеріївна
Рецензент Романенко Сергій Вячеславович
Рецензент Цупіков Олег Михайлович
Установа, організація, у вченій раді якої відбудеться/відбувся захист
Інститут фізіології імені О. О. Богомольця Національної академії наук України
Опис
Довготривала синаптична пластичність є фізіологічним підґрунтям процесів запам’ятовування, набуття навичок і формування досвіду. Одним з основних різновидів довготривалої пластичності в глутаматергічних синапсах є NMDA-рецептор залежна довготривала синаптична депресія (long-term depression/LTD). В основі розвитку LTD є тривале зменшення кількості глутаматних AMPA-рецепторів на мембрані постсинаптичного нейрона, що призводить до зниження здатності окремих синапсів передавати збудливі сигнали. Широко відомо, що розвиток LTD відбувається у відповідь на тривалу, але низькочастотну, активацію синапсів і вторинним посередником в цьому процесі виступають іони Ca2+ які на початкових етапах індукції LTD надходять через активовані глутаматні NMDA-рецептори. Подальші сигнальні каскади провокують дисоціацію AMPA-рецепторів з ділянки постсинаптичної щільності та їх вилучення з плазматичної мембрани дендрита шляхом клатрин-опосередкованого ендоцитозу (clathrin-mediated endocytosis/CME). Однак точні механізми що забезпечують Ca2+-залежність і локалізацію CME в процесі індукції LTD залишались маловивченими. Наявні дослідження висували нейронний Ca2+-сенсорний білок гіпокальцин (hippocalcin/HPCA) на роль потенційної сигнальної ланки в індукції LTD. Особливість HPCA полягає в наявності міристильного перемикача, залишку жирної кислоти на N-кінці білка, що вивільняється з гідрофобної кишеньки молекули після зв’язування з Ca2+. Це обумовлює здатність HPCA до Ca2+-залежного та оборотного вбудовування до ліпідних мембран. Згідно з попередніми дослідженнями, HPCA забезпечує Ca2+-залежне доставлення до поверхні мембран комплексу адаптерних білків 2, що взаємодіє з AMPA-рецепторами та ініціює CME. Однак ці дослідження ґрунтувались виключно на біохімічних, імунологічних на непрямих електрофізіологічних методах, без прямого спостереження за досліджуваними білками в процесі індукції LTD. Тому метою дисертаційного дослідження було визначити участь HPCA в процесі індукції NMDA-рецептор залежної LTD з використанням методів флуоресцентного мічення білків і флуоресцентної візуалізації їх переміщень і взаємодій у живих клітинах.
Для фармакологічної індукції NMDA-рецептор залежної LTD в первинній культурі нейронів гіпокампа було розроблено та валідовано нову методику тривалих локальних іонофоретичних прикладань NMDA. Новий підхід дозволив гнучко та ефективно моделювати LTD у поодиноких нейронах. Можливість застосовувати іонофорез для тривалих прикладань будь-яких полярних водорозчинних речовин в широкому спектрі експериментальних підходів робить створений метод перспективною альтернативою обробки всіх клітин в зразку розчином із фармакологічними препаратами (bath-application).
У дослідах із використанням флуоресцентної мітки постсинаптичної щільності (PSD95) було оцінено просторові характеристикам Ca2+-залежного перерозподілу HPCA в дендритному дереві у відповідь на активацію NMDA-рецепторів. Виявлено, що регіони вбудовування HPCA є гетерогенними вздовж всього дендритного дерева та спостерігається значне накопичення HPCA в дендритних шипиках. Важливо зауважити, що вбудування HPCA в межах дендритних шипиків спостерігались виключно в регіонах, що оточували постсинаптичну щільність. Виявлені регіони цитоморфологічно відповідають зонам ендоцитозу, регіонам що забезпечують активне вилучення синаптичних рецепторів. Подальші прямі спостереження за взаємною локалізацією та потенційною взаємодією між HPCA та β-субодиницею комплексу адаптерних білків 2 (AP2B1) як у контрольних умовах, так і процесі індукції LTD були проведені з використанням підходів для детектування Фьорстеровського резонансного перенесення енергії (FRET). В структурі дендритних шипиків було виявлено значущі рівні FRET до початку індукції LTD. Натомість у відповідь на протокол індукції LTD збільшення рівнів FRET спостерігалось як в дендритних шипиках, так і значних ділянках вздовж стовбуру дендрита, а по завершенню протоколу величина FRET не демонструвала повернення до початкових значень. Це є вагомими свідченнями щодо взаємодії між HPCA та AP2B1, яка може обумовлювати як конститутивний трафік рецепторів в зонах ендоцитозу дендритних шипиків, так і необоротне збільшення рівня ендоцитозу AMPA-рецепторів на стадіях індукції та підтримання LTD.
Дата реєстрації
2025-07-25
Додано/оновлено в НРАТ
2025-07-25 / 2026-07-01
